MVE1830HE气相液氮储存系统储存脐带血造血干细胞效果的分析
【摘要】 目的 上海市血液中心脐带血库在国内首次采用MVE1830HE气相液氮储存系统储存脐带血，并对干细胞的储存效果进行客观评价。 方法 通过两次离心法将脐带血储存体积缩小至20ml，分析脐带血样本在MVE1830HE气相液氮储存系统中储存7个月复苏后，有核细胞总数、CD34 + 细胞数量和造血祖细胞集落形成单位(CFU-GM)的回收率，评价气相液氮储存系统储存效果。 结果 96份新生儿脐带血复苏后有核细胞复苏后仍获得较高的产率，达到(8.66±3.32)×10 8 ，复苏后CFU-GM计数达(82.58±80.20)/2×10 5 ，复苏后CD34 + 细胞数达到(7.36±3.29)×10 6 。比较脐带血有核细胞冻存前后各组数据，结果P>0.05，差异无显著性。 结论 MVE1830HE气相液氮储存系统储存脐血造血干细胞的效果较为理想，适合于各种脐血库和细胞库的应用。
【关键词】 脐带血;脐带血库;气相液氮储存
脐带血是胎儿娩出之后残留在胎盘内的血液，该血液对胎儿、产妇均无益处。临床上常将之随胎盘一起丢弃。到了七十年代，科学家发现脐带血中富含造血干细胞。脐血中的造血干细胞不断分化形成血液中的红细胞、白细胞、血小板，取代血液中衰老、死亡的血细胞，维持人体的各种生理功能。由于脐带血中含有丰富的造血干细胞，所以可以代替骨髓移植治疗白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤，地中海贫血，再生障碍性贫血等肿瘤和造血系统遗传性疾病，而且均取得了良好的疗效，世界各国纷纷建立脐血库以开展脐血移植 [1，2] 。如何有效地储存脐带血造血干细胞，保证其质量和临床移植的有效性，已成为该领域日益关注的重点。上海市血液中心脐带血库为国内首家采用MVE1830HE气相液氮储存系统的脐带血库，本文对MVE1830HE气相液氮储存系统冻存前后有脐带血造血干细胞中的有核细胞数量、细胞存活率、CD34 + 细胞数量和增值能力等进行了检测，并对结果作出客观分析，为国内外同行今后工作参考提供了方便。
1 资料与方法
1.1 样本采集 使用ACB-B抗凝采血袋(上海市血液中心)，采集健康产妇，足月分娩的新生儿脐带血，4℃保存，24h处理。
1.2 有核细胞的分离 6%的羟乙基淀粉氯化钠溶液(Baxter公司)与含抗凝剂的脐血按1:4比例完全混匀后 [3] ，经正置离心，50×g，10℃，5min，去除大部分红细胞。然后再经400×g，10℃正置离心10min，调节自动压浆机，压除大部分血浆，控制脐带血最终储存体积为20ml。
1.3 有核细胞的冻存 在冰水浴中将浓缩分离后的有核细胞和含50%二甲基亚砜(DMSO)及等量低分子右旋糖酐(Dextran)混合 [4～6] ，DMSO终浓度为10%。将混合后的脐带血放到深低温贮存袋(Baxter公司)内，真空密合后装入不锈钢冷冻盒内，并立即将其放入-80℃低温冰箱中，2h后转移至MVE1830HE气相液氮储存系统长期存放 [7] 。
1.4 有核细胞收集 将标本从MVE1830HE气相液氮储存系统中迅速取出，立即放入37℃水浴内解冻。用无菌注射器加入等量含5%人血清白蛋白的Dextran洗涤液，充分混匀后抽取上述样本，置无菌离心管中400×g，10℃离心10min，离心后弃去上清液，再加入与沉淀等量的IMDM(华美生物科技)，混匀洗涤，再次离心，350×g，10℃离心10min，弃上清，收集有核细胞富集层。
1.5 有核细胞的检测
1.5.1 MNC计数 用3%冰醋酸作细胞稀释液，在低倍镜下计数MNC，计算MNC回收率。
1.5.2 台盼蓝拒染试验计数 0.2%台盼蓝生理盐水液与细胞悬液等量混合，2min后在高倍镜下计数每100个MNC排斥台盼蓝的存活细胞数。1.5.3 CFU-GM测定 用甲基纤维素法测定CFU-GM [8] 。接种MNC2×106至Methocult TMGF H4534(STEM-CELL公司，CANADA)培养基(该培养体系每毫升IMDM液中含0.9%甲基纤维素，30%胎牛血清，1%牛血清，10-4M2-巯基乙醇，2-mML-谷胺酰胺，50ng rh SCF，10ng rh GM-CSF，10ng rh1L-3)中，充分混匀后，放入37℃、5%CO 2 和全饱和湿度的恒温箱培养14天。在倒置显微镜下计算CFU-GM的生长集落(≥50个粒单系细胞的细胞团为一个集落)数。
1.5.4 CD34 + 细胞计数 在两个小试管中加入20μl CD45FITC，并分别加入20μl IgG1PE阴性对照和20μl CD34PE。在两管中各加入脐血样品100μl，充分混匀后在室温中避光放置15min。各加NH 4 CL溶液，充分混匀后37℃水浴箱放置15min后1000rpm离心5min。吸出后各加入4ml PB-SC液混匀后1000rpm离心5min，丢上清，加入0.5mlPBSC。流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 脐血采集情况 96份新生儿脐带血的平均采集量为 (66.16±16.68)ml，有核细胞总数为(11.16±5.12)×10 8 。2.2 脐血中有核细胞分离结果 6%的羟乙基淀粉两次离心浓缩法分离脐血中有核细胞效果较好，96份脐带血样本最终冻存体积为20ml。有核细胞总数为(9.85±3.21)×10 8 ，CD34 + 细胞数量(8.29±3.22)×10 6 ，造血祖细胞集落形成单位单位CFU-GM计数为:(96.15±81.38)/2×10 5 。细胞活力，台盼蓝拒染率为(94.11±0.62)%。
2.3 脐血造血干细胞复苏回收率 在MVE1830HE气相液氮系统中储存7个月，脐带血样本复苏后有核细胞总数为(8.66±3.32)×10 8 ，复苏回收率为87.92%。复苏后CD34 + 细胞数量为(7.36±3.29)×10 6 ，复苏回收率为88.78%。造血祖细胞集落形成单位单位复苏后CFU-GM计数为(82.58±80.20)/2×10 5 ，复苏回收率为85.89%。细胞活力，台盼蓝拒染率达(83.25±2.71%)，复苏回收率为88.46%。
2.4 统计学分析 利用方差分析，比较脐带血有核细胞冻存前后各组数据，结果P>0.05，差异无显著性，详见表1。
表1 脐带血有核细胞冻存前后各项指标的比较(略)
3 讨论
与传统的冷冻设备来比，MVE1830HE气相液氮储存系统最大的特点是其无与伦比的安全可靠性:人员在存取样本时完全在液氮蒸气中操作，不会直接接触液氮本体，降低了被低温冻伤的风险。样本存储在气相液氮中完全避免了由于密封性不好，所造成的病原体交叉污染的严重后果。另外MVE1830HE气相液氮储存系统还配备了专门设计和偏移式补偿盖，使整个系统95%的空间被真空绝热保护，从而使样本一直保持在-190℃的环境里。其真空保护能提供持续超过20天的这一低温，而不需补充液氮。其附加控制选项提供电源备分功能(可防止电源供给故障)，及热气旁路功能，在充灌氮时可将气体放空，将液氮蒸发损失尽量降低，因此气相液氮罐的营运费用也是最低的。
深低温保存法是目前唯一能将材料的变化降至最低的方法。深低温保存法已被使用很多年，用来保持细胞和组织的活性。几乎所有深冷储存的生物样本都有临界温度，也叫做玻璃化温度，通常在-130℃～-135℃之间。高于这个温度冷冻样本的长期可存活性将会降低。深低温储存系统的最重要的因数是确保在最小临界温度下保持一个持续的温差段。该温差段的上限要比该材料的临界温度低得多，以避免在储存和取放时造成影响或损坏。活细胞的临界温度低于-130℃;因此将活细胞储存在-150℃～-196℃就比较理想。本实验通过对96例脐带血样本在MVE1830HE气相液氮储存系统(-190℃)中存储复苏的数据分析，证明气相液氮储存脐血造血干细胞的效果较为理想，适合于各种脐血库和细胞库的应用。
【参考文献】
1 Rubinstein P，Carry C，Scaradavou A，et al.Outcomes among562recipi-ents of placental-blood transplants from unrelated donors.N Engl JMed，1998，339，1565-1567.
2 Gluckman E.Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation.Exp Hematol，2000，28，1197-1205.
3 Katayama Y，Yano T，Bessho A，et al.The effects of simplified method for cryopreservation and thawing procedures on peripheral blood temcells.BMT，1997，19:283-287.
4 Takuae Y，Abe T，Kawano Y，et al.Comparative analysis fo engraftment after cryopreservation of peripheral blood stem cell autografts by con-trolled-versus uncontrolled-rate methods.BMT，1994，13:801-804.
5 Broxmeyer HE，Cooper S.Hihg efficiency recovery of immature hae-matopoietic progenitor cells with extensive proliferative capacity fromhu-man cord blood cryopreserved for10years.Clin Exp Immunol，1997，107(suppl1):45-53.
6 Rowley SD，Bendinger WL，Gooley，TA，et al.Effect of Dmso exposure without cryopreservation on hematopoietic progenitor cell.BMT，1993，11:389-393.
7 朱为国，邢献忠，黄志光，等.脐血造血细胞低温储存方法探讨.中国输血杂志，1996，9(2):58-60.
8 唐佩弦，杨天楹.造血细胞培养技术.西安:陕西科学技术出版社，1985，115.
作者单位:
1200051上海，上海市血液中心
2200051上海，上海市脐带血库
(编辑:悦 铭), http://www.100md.com(陈亮 陆琼 冯明亮 王峰蕾 潘芸 余莉莎 王玮莉 周奚斌 孙鲁申)
【关键词】 脐带血;脐带血库;气相液氮储存
脐带血是胎儿娩出之后残留在胎盘内的血液，该血液对胎儿、产妇均无益处。临床上常将之随胎盘一起丢弃。到了七十年代，科学家发现脐带血中富含造血干细胞。脐血中的造血干细胞不断分化形成血液中的红细胞、白细胞、血小板，取代血液中衰老、死亡的血细胞，维持人体的各种生理功能。由于脐带血中含有丰富的造血干细胞，所以可以代替骨髓移植治疗白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤，地中海贫血，再生障碍性贫血等肿瘤和造血系统遗传性疾病，而且均取得了良好的疗效，世界各国纷纷建立脐血库以开展脐血移植 [1，2] 。如何有效地储存脐带血造血干细胞，保证其质量和临床移植的有效性，已成为该领域日益关注的重点。上海市血液中心脐带血库为国内首家采用MVE1830HE气相液氮储存系统的脐带血库，本文对MVE1830HE气相液氮储存系统冻存前后有脐带血造血干细胞中的有核细胞数量、细胞存活率、CD34 + 细胞数量和增值能力等进行了检测，并对结果作出客观分析，为国内外同行今后工作参考提供了方便。
1 资料与方法
1.1 样本采集 使用ACB-B抗凝采血袋(上海市血液中心)，采集健康产妇，足月分娩的新生儿脐带血，4℃保存，24h处理。
1.2 有核细胞的分离 6%的羟乙基淀粉氯化钠溶液(Baxter公司)与含抗凝剂的脐血按1:4比例完全混匀后 [3] ，经正置离心，50×g，10℃，5min，去除大部分红细胞。然后再经400×g，10℃正置离心10min，调节自动压浆机，压除大部分血浆，控制脐带血最终储存体积为20ml。
1.3 有核细胞的冻存 在冰水浴中将浓缩分离后的有核细胞和含50%二甲基亚砜(DMSO)及等量低分子右旋糖酐(Dextran)混合 [4～6] ，DMSO终浓度为10%。将混合后的脐带血放到深低温贮存袋(Baxter公司)内，真空密合后装入不锈钢冷冻盒内，并立即将其放入-80℃低温冰箱中，2h后转移至MVE1830HE气相液氮储存系统长期存放 [7] 。
1.4 有核细胞收集 将标本从MVE1830HE气相液氮储存系统中迅速取出，立即放入37℃水浴内解冻。用无菌注射器加入等量含5%人血清白蛋白的Dextran洗涤液，充分混匀后抽取上述样本，置无菌离心管中400×g，10℃离心10min，离心后弃去上清液，再加入与沉淀等量的IMDM(华美生物科技)，混匀洗涤，再次离心，350×g，10℃离心10min，弃上清，收集有核细胞富集层。
1.5 有核细胞的检测
1.5.1 MNC计数 用3%冰醋酸作细胞稀释液，在低倍镜下计数MNC，计算MNC回收率。
1.5.2 台盼蓝拒染试验计数 0.2%台盼蓝生理盐水液与细胞悬液等量混合，2min后在高倍镜下计数每100个MNC排斥台盼蓝的存活细胞数。1.5.3 CFU-GM测定 用甲基纤维素法测定CFU-GM [8] 。接种MNC2×106至Methocult TMGF H4534(STEM-CELL公司，CANADA)培养基(该培养体系每毫升IMDM液中含0.9%甲基纤维素，30%胎牛血清，1%牛血清，10-4M2-巯基乙醇，2-mML-谷胺酰胺，50ng rh SCF，10ng rh GM-CSF，10ng rh1L-3)中，充分混匀后，放入37℃、5%CO 2 和全饱和湿度的恒温箱培养14天。在倒置显微镜下计算CFU-GM的生长集落(≥50个粒单系细胞的细胞团为一个集落)数。
1.5.4 CD34 + 细胞计数 在两个小试管中加入20μl CD45FITC，并分别加入20μl IgG1PE阴性对照和20μl CD34PE。在两管中各加入脐血样品100μl，充分混匀后在室温中避光放置15min。各加NH 4 CL溶液，充分混匀后37℃水浴箱放置15min后1000rpm离心5min。吸出后各加入4ml PB-SC液混匀后1000rpm离心5min，丢上清，加入0.5mlPBSC。流式细胞仪检测。
2 结果
2.1 脐血采集情况 96份新生儿脐带血的平均采集量为 (66.16±16.68)ml，有核细胞总数为(11.16±5.12)×10 8 。2.2 脐血中有核细胞分离结果 6%的羟乙基淀粉两次离心浓缩法分离脐血中有核细胞效果较好，96份脐带血样本最终冻存体积为20ml。有核细胞总数为(9.85±3.21)×10 8 ，CD34 + 细胞数量(8.29±3.22)×10 6 ，造血祖细胞集落形成单位单位CFU-GM计数为:(96.15±81.38)/2×10 5 。细胞活力，台盼蓝拒染率为(94.11±0.62)%。
2.3 脐血造血干细胞复苏回收率 在MVE1830HE气相液氮系统中储存7个月，脐带血样本复苏后有核细胞总数为(8.66±3.32)×10 8 ，复苏回收率为87.92%。复苏后CD34 + 细胞数量为(7.36±3.29)×10 6 ，复苏回收率为88.78%。造血祖细胞集落形成单位单位复苏后CFU-GM计数为(82.58±80.20)/2×10 5 ，复苏回收率为85.89%。细胞活力，台盼蓝拒染率达(83.25±2.71%)，复苏回收率为88.46%。
2.4 统计学分析 利用方差分析，比较脐带血有核细胞冻存前后各组数据，结果P>0.05，差异无显著性，详见表1。
表1 脐带血有核细胞冻存前后各项指标的比较(略)
3 讨论
与传统的冷冻设备来比，MVE1830HE气相液氮储存系统最大的特点是其无与伦比的安全可靠性:人员在存取样本时完全在液氮蒸气中操作，不会直接接触液氮本体，降低了被低温冻伤的风险。样本存储在气相液氮中完全避免了由于密封性不好，所造成的病原体交叉污染的严重后果。另外MVE1830HE气相液氮储存系统还配备了专门设计和偏移式补偿盖，使整个系统95%的空间被真空绝热保护，从而使样本一直保持在-190℃的环境里。其真空保护能提供持续超过20天的这一低温，而不需补充液氮。其附加控制选项提供电源备分功能(可防止电源供给故障)，及热气旁路功能，在充灌氮时可将气体放空，将液氮蒸发损失尽量降低，因此气相液氮罐的营运费用也是最低的。
深低温保存法是目前唯一能将材料的变化降至最低的方法。深低温保存法已被使用很多年，用来保持细胞和组织的活性。几乎所有深冷储存的生物样本都有临界温度，也叫做玻璃化温度，通常在-130℃～-135℃之间。高于这个温度冷冻样本的长期可存活性将会降低。深低温储存系统的最重要的因数是确保在最小临界温度下保持一个持续的温差段。该温差段的上限要比该材料的临界温度低得多，以避免在储存和取放时造成影响或损坏。活细胞的临界温度低于-130℃;因此将活细胞储存在-150℃～-196℃就比较理想。本实验通过对96例脐带血样本在MVE1830HE气相液氮储存系统(-190℃)中存储复苏的数据分析，证明气相液氮储存脐血造血干细胞的效果较为理想，适合于各种脐血库和细胞库的应用。
【参考文献】
1 Rubinstein P，Carry C，Scaradavou A，et al.Outcomes among562recipi-ents of placental-blood transplants from unrelated donors.N Engl JMed，1998，339，1565-1567.
2 Gluckman E.Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation.Exp Hematol，2000，28，1197-1205.
3 Katayama Y，Yano T，Bessho A，et al.The effects of simplified method for cryopreservation and thawing procedures on peripheral blood temcells.BMT，1997，19:283-287.
4 Takuae Y，Abe T，Kawano Y，et al.Comparative analysis fo engraftment after cryopreservation of peripheral blood stem cell autografts by con-trolled-versus uncontrolled-rate methods.BMT，1994，13:801-804.
5 Broxmeyer HE，Cooper S.Hihg efficiency recovery of immature hae-matopoietic progenitor cells with extensive proliferative capacity fromhu-man cord blood cryopreserved for10years.Clin Exp Immunol，1997，107(suppl1):45-53.
6 Rowley SD，Bendinger WL，Gooley，TA，et al.Effect of Dmso exposure without cryopreservation on hematopoietic progenitor cell.BMT，1993，11:389-393.
7 朱为国，邢献忠，黄志光，等.脐血造血细胞低温储存方法探讨.中国输血杂志，1996，9(2):58-60.
8 唐佩弦，杨天楹.造血细胞培养技术.西安:陕西科学技术出版社，1985，115.
作者单位:
1200051上海，上海市血液中心
2200051上海，上海市脐带血库
(编辑:悦 铭), http://www.100md.com(陈亮 陆琼 冯明亮 王峰蕾 潘芸 余莉莎 王玮莉 周奚斌 孙鲁申)